多肽的分離純化工藝舉例（2-3步）

常用工藝

一、尺寸排阻色譜

* 利用色譜填料的細(xì)孔徑、基于分析物尺寸大小達(dá)成分離的模式

* 優(yōu)勢

1.?色譜條件單純，利于品質(zhì)管理的使用

2.?根據(jù)分子量（尺寸）大小可以預(yù)判洗脫位置

* 缺點(diǎn)

1.?樣品可進(jìn)樣量相對較小

2.?分析物可能會與固定相（色譜填料）發(fā)生疏水相互作用

* 流動相推薦

1.?流動相：0.1 % TFA＋ 45% 乙腈（0.1 % TFA非必須）

2.?同種流動相，含有蛋白組分時蛋白的空間構(gòu)造被破壞，分子呈伸展?fàn)顟B(tài)（變性），

這時候進(jìn)行分子量表征時，使用100 %水溶液條件下標(biāo)準(zhǔn)蛋白校正曲線不合適

3.?含0.1 % TFA的流動相分析疏水性高的多肽時，如果洗脫較遲，可以推薦使用醋酸溶液等

二、反相色譜

* 基于分析組分在兩相間的分配差異而達(dá)成分離的模式

* 優(yōu)勢

1.?分辨率非常高

2.?適合聯(lián)用MS檢測

3.?精制純化時，使用揮發(fā)性的鹽可省時省力

4.?選擇性、保留的差異豐富→ C18, C8, C4, CN, Phenyl, 碳含量?導(dǎo)入方式、細(xì)孔徑、粒徑

* 缺點(diǎn)

1.?樣品處理量相對較小

2.?使用有機(jī)溶劑

3.?樣品的保留、平衡、重復(fù)性→ 低（無）有機(jī)溶劑濃度或使用離子對試劑時，需進(jìn)行充分的平衡

* 流動相推薦

有機(jī)溶劑（乙腈、甲醇）不同，分離選擇性不同（40 %的乙腈與60 %的甲醇，保留能力基本相同）

杜邦樹脂在多肽純化中的應(yīng)用

二、離子交換色譜

* 利用靜電相互作用程度差異達(dá)成分析組分分離的模式

* 優(yōu)勢

1.?分辨率高

2.?樣品處理量大（載量高，尤其適合純化制備）

* 缺點(diǎn)

1.?由于使用鹽進(jìn)行洗脫，不適合MS聯(lián)用檢測

2.?分析物可能會與固定相（色譜填料）發(fā)生疏水相互作用

* 流動相推薦

1.?流動相：含有機(jī)溶劑的鹽緩沖液，利用鹽或pH的梯度洗脫

2.?陽離子交換色譜一般使用酸性溶液體系；陰離子交換色譜一般使用中性或弱堿性溶液體系

3.?對于疏水性高的多肽，要注意可能會發(fā)生洗脫相對遲緩的現(xiàn)象

東曹離子交換填料在胰島素純化中的應(yīng)用

已做案例----抗菌肽