寡核苷酸的HPLC分析方法
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治療性寡核苷酸是由固相化學(xué)合成工藝生產(chǎn)。在合成過程中會(huì)產(chǎn)生工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)包含許多目標(biāo)產(chǎn)物的類似物（分子量的差別：堿基數(shù)N-1、N、N+1等），磷酸基S化等的不對(duì)稱化合物、異構(gòu)體等。因此，雜質(zhì)的分析監(jiān)控對(duì)工藝和質(zhì)量控制就顯得十分重要。液相色譜技術(shù)具有樣品適用范圍廣、分離效率高、速度快等特點(diǎn)，已成為核酸藥物生產(chǎn)與質(zhì)控分析必不可少的重要手段。
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圖1?寡核苷酸的磷酸化及糖基修飾
磷酸化修飾：空間配置引起的異構(gòu)體（但都是有效成分）
糖基修飾：通過架橋增強(qiáng)對(duì)核酸酶的耐受和降低毒性（如嗎琳環(huán)型）
堿基修飾：適配體立體構(gòu)造的多樣性
表1 寡核苷酸分離常用的HPLC分離模式及適用的TSKgel色譜
分離模式 | 分離原理 | 特長及用途 | 適用的色譜柱 |
尺寸排阻色譜（SEC） | 分析物的分子尺寸大小 | 1.可以使用接近生理?xiàng)l件的洗脫溶液進(jìn)行分離 2.基于堿基數(shù)不同分離（Mw） 3.用于質(zhì)量控制或純度含量分析 ? | TSKgel UP-SW系列 |
TSKgel SWXL系列 | |||
TSKgel PWXL系列 | |||
TSKgel G-DNA-PW系列 | |||
離子交換色譜（IEC） | 分析物與固定相間的離子相互作用 | 樣品載量高 | TSKgel DNA-NPR ? |
可以根據(jù)磷酸基的數(shù)量分離樣品（N-1, N, N+1 ） ? | TSKgel DNA-STAT | ||
反相色譜（RPC） | 分析物與填料間疏水性 相互作用 | 分辨率高 結(jié)構(gòu)異構(gòu)體、不對(duì)稱體的分離 | TSKgel Oligo?DNA-RP |
TSKgel ODS-100V | |||
TSKgel Super-ODS | |||
親水作用色譜（HILIC） | 分析物與填料間親水性 相互作用 | 增強(qiáng)HILIC-ESI-MS質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度 （不加離子對(duì)試劑條件下） 結(jié)構(gòu)異構(gòu)體、不對(duì)稱體的分離 ? | TSKgel Amide-80 2μm |
應(yīng)用實(shí)例
質(zhì)粒的HPLC分析方法
隨著基因治療和DNA疫苗的迅速發(fā)展，高純度的質(zhì)粒DNA的需求量越來越大。藥物級(jí)質(zhì)粒DNA必須要符合宿主相關(guān)雜質(zhì)、均一性方面的要求。因此，在質(zhì)粒純度檢測(cè)時(shí)，需要區(qū)分出超螺旋、開環(huán)和線型三種拓?fù)洚悩?gòu)體質(zhì)粒。
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表2?質(zhì)粒分離常用的HPLC分離模式及適用的TSKgel色譜柱
分離模式 | 分離原理 | 特長及用途 | 適用的色譜柱 |
尺寸排阻色譜（SEC） | 分子尺寸大小 （質(zhì)粒分子較大，在排阻V0附近洗脫） | 用于質(zhì)量控制或純度含量分析 | TSKgel G6000PWxl TSKgel G-DNA-PW |
離子交換色譜（IEC） | 電荷的差異 （質(zhì)粒帶高負(fù)電荷） | 分離質(zhì)粒拓?fù)洚悩?gòu)體 | TSKgel DNA-NPR |
疏水色譜（HIC） | 疏水性的差異 | 分離質(zhì)粒拓?fù)洚悩?gòu)體 | TSKgel Butyl-NPR |
應(yīng)用實(shí)例
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